2020年12月9日，PCCP（phys.chem.chem.phys）期刊發(fā)表文章《DOPC versus DOPE as a helper lipid for gene-therapies: molecular dynamics simulations with DLin-MC3-DMA》^[1]。該文章使用分子模擬手段分析使用同一種陽離子脂質(zhì)DLin-MC3-DMA與兩種不同的輔助磷脂（DOPC和DOPE）構(gòu)建兩種脂質(zhì)體體系進(jìn)行模擬。分析兩種合成磷脂形成的脂質(zhì)體差異。為將來理性化設(shè)計脂質(zhì)體提供可行性。

摘要：

可電離陽離子脂質(zhì)是基因治療遞送系統(tǒng)脂質(zhì)納米顆粒 (LNP) 的重要組成成分。 DLin-MC3-DMA 是有前途的可電離陽離子脂質(zhì)（或胺脂質(zhì)）之一。根據(jù)它們在藥物中的應(yīng)用，在包裹核酸的LNP中還包含各種輔助脂質(zhì)，例如磷酸化和聚乙二醇化脂質(zhì)、膽醇等。由于其復(fù)雜的成分，這些基因療法中應(yīng)用的LNP結(jié)構(gòu)改進(jìn)較為困難，并且尚未確定每種脂質(zhì)在LNP的藥理作用。在這項工作中，構(gòu)建了DLin-MC3-DMA中性形式的原子模型，并進(jìn)行了全原子模型行下的分子動力學(xué) (MD) 模擬，以研究LNP中合成磷脂頭部基團(tuán)對細(xì)胞膜可能存在的影響。在中性條件下（ pH = 7.4）構(gòu)建并模擬了含有兩種不同摩爾比的 DLin-MC3-DMA（5%和15%）的DOPC及DOPE 脂質(zhì)的雙層。MD軌跡分析結(jié)果顯示DOPE脂質(zhì)頭部基團(tuán)與DLin-MC3-DMA尾部密切相關(guān)，而DOPC脂質(zhì)的頭部基團(tuán)未觀察到這種顯著關(guān)聯(lián)。此外，DOPE和DLin-MC3-DMA之間較強(qiáng)的聯(lián)系導(dǎo)致DLin-MC3-DMA固定在膜表面。脂質(zhì)之間的相互作用減慢了兩個雙層膜體系的橫向擴(kuò)散，其中在含有DOPE的體系中觀察到擴(kuò)散速率的降低更為顯著。這也解釋利用磷脂酰乙醇胺構(gòu)建的脂質(zhì)體雙層膜（DOPE/DLin-MC3-DMA）具有較低的水滲透性，并且可能與其較差的轉(zhuǎn)染特性有關(guān)。

圖1：分子動力學(xué)模擬的脂質(zhì). (a) DLin-MC3-DMA. (b) 構(gòu)建DLin-MC3-DMA力場參數(shù)的部分. (c) DOPC,18:1 (Δ9 – cis) PC. (d) DOPE, 18:1(Δ9 – cis) PE.

模擬方法：

1. DLin-MC3-DMA模型的參數(shù)化

DLin-MC3-DMA模型參數(shù)的構(gòu)建參考了多不飽和磷脂相同的原理，由于LNP周圍的環(huán)境通常為中性，因此設(shè)置總電荷為零以模擬中性條件下的可電離陽離子脂質(zhì)的模型，MD模擬過程中并不會用到該化合物的電離狀態(tài)。

參考已有的用于多不飽和磷酸酯的SLipids力場（FF）推導(dǎo)DLin-MC3-DMA的力場參數(shù)。SLipids FF的一般形式為：

E_FF = E_bonded + E_non-bonded

E_bonded = E_angles + E_dihedrals + E_bonds + E_{Urey–Bradley}

E_non-bonded = E_{Lennard-Jones} + E_Coulomb

本研究中，重點是計算陽離子脂質(zhì)的頭部基團(tuán)的電荷以及二面體參數(shù)，而脂質(zhì)尾部的二面體參數(shù)可以直接調(diào)用SLipids FF中已知的不飽和脂質(zhì)中的參數(shù)，脂質(zhì)尾部的電荷參考已有電荷進(jìn)行略微調(diào)整即可。

由于DLin-MC3-DMA的全原子量化計算所需的時間較長，計算機(jī)內(nèi)存要求較高，為了便于計算，使用高斯gaussian09軟件，利用B3LYP方法，CC-pVTZ基組以及RESP靜電勢約束方法對DLin-MC3-DMA的等效小模型（圖1b）進(jìn)行了電荷計算。在IEFPCM模型中，脂質(zhì)體的頭部基團(tuán)被放置在介電常數(shù)為78.4的可極化連續(xù)體系中，模擬溶劑效應(yīng)以及對電荷分布的誘導(dǎo)極化。具體電荷參數(shù)可在support文件中查閱。

在計算出部分原子電荷后，參考之前的SLipids FF相同的原理推導(dǎo)出新的二面體參數(shù)。二面角參數(shù)可以在support文件圖S2中查閱。與多不飽和脂質(zhì)的力場參數(shù)一樣，原始分子使用二階Møller–Plesset擾動原理以及CC-pVDZ基組進(jìn)行優(yōu)化，在-180度到180度的區(qū)間里，設(shè)置10度為步長，保持其他自由度不變，通過圍繞二面角旋轉(zhuǎn)優(yōu)化分子。為了計算不同角度的構(gòu)象下的相對量子力學(xué)能量，采取了相互作用能的混合方法（HM-IE），關(guān)系是為：

E_CCSD(T)/BBS = E_CCSD(T)/SBS + E_CCSD(T)/BBS − E_CCSD(T)(SBS) ≈ E_CCSD(T)/SBS + E_MP2/BBS − E_MP2/SBS

其中MP2表示二階Møller–Plesset擾動原理，CCSD（T）是耦合簇理論中的耦合簇單雙和微擾三激發(fā)方法。SBS表示小基組（cc-pVDZ）,BBS表示大基組（cc-pVQZ）。

完成高階量子化學(xué)計算后，所得值可以利用如下方程擬合二面體勢：

E_dihedral = (E_CCSD(T)/BBS − E_MD) − (E_CCSD(T)/BBS − E_MD)_min

這里的EMD表示勢能的值，利用MD軟件，設(shè)置二面角的參數(shù)設(shè)置為0時可以得到EMD的值。二面體擬合的極限約為 2 kJ/mol。此外，新計算得到的二面體勢能用于新型陽離子脂質(zhì)，并在其力場文件中新增CTL6、NL和CL2原子類型。其他 FF 參數(shù)，例如鍵的參數(shù)、二面角的缺失值以及Urey-Bradley和角度參數(shù)均取自SLipids FF和CHARMM36 FF中已有的原子類型（CTL5、NH3L 和 CTL2）

2. 分子模擬參數(shù)設(shè)置

模擬體系詳見表一，首先，構(gòu)建了兩種脂質(zhì)雙分子層，一種*由DOPC組成，一種*由DOPE構(gòu)成。每個雙層膜都由100個包含兩個磷脂的膜單體組成，一個處于直立，一個處于倒立（非鏡像對稱）。構(gòu)建好的兩種雙層膜用于構(gòu)建不同含量的DLin-MC3-DMA的膜，在選定好的位置（距離10A）的磷脂雙層膜中，刪除磷脂，插入優(yōu)化后的DLin-MC3-DMA分子代替。

表1 模擬體系組分

每個創(chuàng)建好的模擬系統(tǒng)在NPT系綜下平衡 300 ns，然后再平衡模擬300 ns。模擬體系采用 1個標(biāo)準(zhǔn)大氣壓的壓力并且使用Berendsen恒壓器進(jìn)行壓力耦合，溫度設(shè)置恒定，保持在 298 K。算法采用牛頓運動方程式，設(shè)置步長為 2 fs 的leap-frog，采用截斷半徑為1.2nm的范德華式Verlet截斷方案。鍵長使用 LINCS 算法進(jìn)行 12 次迭代限制。MD模擬和所得軌跡的分析是使用gromacs-4.6.7軟件完成的。

3. 動力學(xué)模擬優(yōu)化設(shè)置

對DLin-MC3-DMA的4個體系進(jìn)行經(jīng)典的MD平衡模擬，確定能量最小化，體系達(dá)到穩(wěn)定。對于每個脂質(zhì)雙層，創(chuàng)建了5種不同的模擬起始條件。這些設(shè)置用于對每個脂質(zhì)雙層進(jìn)行 5 次平行的動力學(xué)模擬。

廣義坐標(biāo)值 (CV) 被選為水分子質(zhì)心與脂質(zhì)雙層之間距離（見圖 2）。 高斯函數(shù)的高度為 1.2 kJ mol−1。 它們的寬度為 0.05 nm（參數(shù) σ），每 500 步（參數(shù) PACE 的值）沉積一次。 由于水分子的小尺寸，偏差因子γ被設(shè)置為10.0。

圖2 初始動力學(xué)模擬的廣義坐標(biāo)。 紅色小分子是水分子，青色分子是脂質(zhì)。 為清楚起見，省略了所有其他水分子。 “CV”是坐標(biāo)值，“PMF”是自由能勢能面。

所有模擬都是在NVT系綜中，恒溫298K下，使用V-rescale熱浴進(jìn)行。牛頓運動方程的積分器是跳躍式的，采用時間步長為 2 fs 和Verlet截斷方案，其中截止半徑為 1.2 nm。 LINCS 算法被用于約束 12 次迭代的鍵長。 用作MD模擬的軟件是 gromacs-4.6.7，用于自由能計算的 plumed-2.1.262。 每次模擬進(jìn)行150 ns。

結(jié)果與討論

圖3：系統(tǒng)截取的一幀快照：正面視圖和體系頂部的視圖。(a) DOPC和5%的DLin-MC3-DMA (b) DOPE和5%的DLin-MC3-DMA，(c) DOPC 和 15% 的 DLin-MC3-DMA 和 (d) DOPE 和 15% DLin-MC3-DMA。磷脂以青色顯示，磷以深石灰色球體顯示。DLin-MC3-DMA 以深藍(lán)色顯示。圖片采用VMD軟件繪制

在（a）和（b）中，分別在 DOPC 和 DOPE 膜中 DLin-MC3-DMA 的定位沒有觀察到顯著差異：DLin-MC3-DMA均位于靠近雙層膜表面的位置。 圖 3(c) 和 (d) 展示了磷脂含量較低的體系中，DLin-MC3-DMA 表現(xiàn)出偏好位于具有 DOPE 的膜表面，而在 DOPC 的情況下，DLin-MC3-DMA在很大程度上分布在雙層的中心。

表2 脂質(zhì)體中各組分的橫向擴(kuò)散速度（10^-7cm²s^-1）

在含有DOPC的系統(tǒng)中，當(dāng)DLin-MC3-DMA的量增加時，DOPC的擴(kuò)散以及DLin-MC3-DMA的擴(kuò)散都會減慢。 在含有 DOPE 的系統(tǒng)中，添加DLin-MC3-DMA比含有 DOPC的膜更顯著地降低了兩種脂質(zhì)的擴(kuò)散。 這可以被認(rèn)為是含有 DLin-MC3-DMA 和 DOPE的 LNP 在質(zhì)粒 DNA 遞送中沒有表現(xiàn)出高轉(zhuǎn)染效率的原因，因為在DNA遞送過程中，橫向擴(kuò)散和膜融合是重要的因素。

表3 脂質(zhì)體大小以及膜厚度

根據(jù)該表，含有DOPC的膜比含有DOPE的膜具有更高的脂質(zhì)體面積。 隨著DLin-MC3-DMA摩爾比的增加，每個脂質(zhì)的平均面積也會增加。 在使用DOPE的體系中，與純膜相比，每個脂質(zhì)的平均面積增長高于使用DOPC的系統(tǒng)。 然而，表3中的值對于每個脂質(zhì)頭部基團(tuán)并不精確，因為DLin-MC3-DMA的脂質(zhì)尾部可能出現(xiàn)在表面，并且在某些幀中，整個陽離子脂質(zhì)可能位于膜的中心，而不出現(xiàn)在雙層表面。 可以從每個脂質(zhì)的面積值得出的結(jié)論是，模擬框在DLin-MC3-DMA摩爾比為15 %時變得更寬。

圖4. 質(zhì)量密度分布圖：(a) DOPC 和 (b) DOPE。 “Pure”代表僅含有磷脂的脂質(zhì)雙層，+5% DLin-MC3-DMA 意味著它是5%的MC3，+15% DLin-MC3-DMA 意味著它是 15% 的MC3.

圖4展示了模擬系統(tǒng)以及含有純磷脂的脂質(zhì)雙層的質(zhì)量密度分布。 隨著 DLin-MC3-DMA 濃度的增加，圖中 (a) 和 (b) 部分都表現(xiàn)出相同的質(zhì)量密度峰值向雙層中心移動的趨勢。 這可以解釋為雙層變薄，因為質(zhì)量密度的最高值與脂質(zhì)頭部集團(tuán)的位置有關(guān)（計算的膜厚度值見表3）。 然而，為了獲得脂質(zhì)分子各個部分所在位置的準(zhǔn)確圖片，應(yīng)計算這些部分對質(zhì)量密度分布的貢獻(xiàn)。

圖 5 質(zhì)量密度分布：（a）DOPC 和 5% 的 DLin-MC3-DMA，（b）DOPE 和 5% 的 DLin-MC3-DMA，（c）DOPC 和 15% 的 DLin-MC3- DMA 和 (d) DOPE 和 15% 的 DLin-MC3-DMA。粉紅色區(qū)域顯示磷脂的 PO4 頭部基團(tuán)的位置。 DLin-MC3-DMA (h) 和 DLin-MC3-DMA (t) 分別表示脂質(zhì)的頭部和尾部。在表示 DLin-MC3-DMA 結(jié)構(gòu)的圖像上，用于計算部分分子質(zhì)量密度的部分用紅色圓圈表示。為了獲得“可比較”的輪廓，僅從頭組中取出氮和兩個碳進(jìn)行計算，而從尾組中取出帶有氫的碳進(jìn)行計算。從圖中磷脂的結(jié)構(gòu)來看，PO4-基團(tuán)被認(rèn)為是脂質(zhì)頭部基團(tuán)的代表，而尾部則用尾部末端的CH3-基團(tuán)表示。 DLin-MC3-DMA 的部分以不同的方式著色：淺灰色 - 氫，深灰色 - 碳，藍(lán)色 - 氮和紅色 - 氧。黑色虛線表示 PO4 基團(tuán)質(zhì)量密度的最大值點。

圖5顯示了兩種脂質(zhì)的頭部和尾部對質(zhì)量密度分布的貢獻(xiàn)。在DLin-MC3-DMA的低濃度 (5 mol%) 可以觀察到兩種磷脂的分布差異（圖 5（a）和（b））：DLin-MC3-DMA 尾部的峰位置位于DOPE頭部區(qū)域，而在DOPC的情況下，該峰出現(xiàn)在磷脂尾部區(qū)域。 DLin-MC3-DMA的頭部基團(tuán)“更喜歡”位于 DOPC 和 DOPE 膜中的磷脂頭之間。

當(dāng)DLin-MC3-DMA的量為 15 mol%（圖 5（c）和（d））時，DLin-MC3-DMA 尾部的峰移到 DOPE 頭部基團(tuán)的區(qū)域外。在 DOPC 膜中，與含有 5 mol% 胺脂的脂雙層相比，該峰的位置沒有改變。此外，與含有 DOPE 的脂質(zhì)雙層相比，位于 DOPC膜中心的DLin-MC3-DMA尾部數(shù)量更多。DLin-MC3-DMA的頭部“更喜歡”位于磷脂頭部的區(qū)域，但在含有 DOPC 的膜中，即使在脂雙層的中心也檢測到少量。 DLin-MC3-DMA 的這種位置與 Ramenzapour等人在模擬 DLin-KC2-DMA 以及POPC 和膽醇，處于中性 pH 值下觀察到的位置略有相似。

然而，脂質(zhì)并不是模擬系統(tǒng)中存在的分子。由于它們的運動，水的運動會受到影響。水也可以滲透膜。在純磷脂雙層中，在雙層中心沒有檢測到大量的水，但DLin-MC3-DMA的添加改變了膜的滲透。例如，5 mol% 的量使 DOPE 脂質(zhì)膜具有滲透性，而在 DOPC 的情況下，滲透性更可忽略不計。在較高濃度的 DLin-MC3-DMA (15 mol%) 情況下，情況正好相反，含有DOPC的雙層的水滲透率高于含有 5 mol% 胺脂質(zhì)時的水滲透率，而對于含有 DOPE 的膜雙層中心水的質(zhì)量密度幾乎為零。

這些發(fā)現(xiàn)表明，在 DLin-MC3-DMA 的低濃度下，脂質(zhì)尾部甲基的質(zhì)量密度峰值出現(xiàn)在 PO4 基團(tuán)區(qū)域內(nèi)（圖 5（b））。這種少量疏水部分的位置可能是質(zhì)子轉(zhuǎn)移中斷的原因，因為在純磷脂雙層中，根據(jù) Brändén 等人和 Yamashita 等人的說法，磷酸基團(tuán)具有“質(zhì)子收集效應(yīng)”此外，磷脂酰堿頭部基團(tuán)周圍的水分子與磷脂酰乙醇胺頭部基團(tuán)周圍的水分子沒有相同的優(yōu)先取向。因此，與具有 DOPC 的脂質(zhì)雙層相比，外來 CH3 基團(tuán)的存在更能導(dǎo)致 DOPE 膜中的孔形成。

在含有 DOPC 的脂質(zhì)雙層中，當(dāng)含有 15 mol% 時，隨著DLin-MC3-DMA濃度的增加，水滲透率略高。這與少量 DLin-MC3-DMA 的頭部基團(tuán)位于由DOPC組成的膜的中心有關(guān)（圖 5（c））。這些頭部基團(tuán)可以起到水分子通過膜的“轉(zhuǎn)運體”的作用。在含有等量 DLin-MC3-DMA 的DOPE的脂質(zhì)雙層中，水滲透的降低可以通過 DLin-MC3-DMA 脂質(zhì)尾部位置的輕微變化來解釋。DLin-MC3-DMA的甲基最大質(zhì)量密度分布向 DOPE 的羰基轉(zhuǎn)移，這可以在該區(qū)域產(chǎn)生疏水層并防止水進(jìn)入膜。

我們只能推測這些關(guān)于分子不同部分對質(zhì)量密度的影響，在較高濃度的DLin-MC3-DMA下緩慢的橫向擴(kuò)散可能與強(qiáng)相互作用有關(guān)，也可能與磷脂的頭部基團(tuán)有關(guān)。特別是，在具有 DOPE脂質(zhì)尾部的膜中，DLin-MC3-DMA似乎與磷脂頭部相關(guān)聯(lián)。為了闡明這一點，我們計算了兩個組分之間的徑向分布函數(shù)（RDF）。

圖 6 磷脂和 DLin-MC3-DMA 頭部基團(tuán)中原子對之間的 RDF。 (a) 來自 DLin-MC3-DMA 的氧與來自 DOPC 的 CH3 基團(tuán)的氫/來自 DOPE 胺基團(tuán)的氫之間的 RDF。 (b) 來自 DLin-MC3-DMA 的氧與來自 DOPC/DOPE 中甘油基團(tuán)的 CH2 基團(tuán)的氫之間的 RDF。 部分磷脂按以下方式著色：青色-碳，藍(lán)色-氮，黃色-磷，紅色-氧，灰色-氫。 DLin-MC3-DMA 的部分以不同的方式著色：淺灰色-氫，深灰色-碳，藍(lán)色-氮和紅色-氧。

圖 7 磷脂頭部和DLin-MC3-DMA尾部原子對之間的RDF。（a）DLin-MC3-DMA中標(biāo)記為“a”的碳與來自DOPC的CH3基團(tuán)的氫/來自DOPE的胺基團(tuán)的氫之間的RDF。 (b) DLin-MC3-DMA 中標(biāo)記為“b”的碳與來自 DOPC 的 CH3 基團(tuán)的氫/來自DOPE的胺基團(tuán)的氫之間的 RDF。(c) DLin-MC3-DMA 中標(biāo)記為“c”的碳與來自 DOPC 的CH3基團(tuán)的氫/來自 DOPE 的胺基團(tuán)的氫之間的 RDF。(d) DLin-MC3-DMA 中標(biāo)記為“d”的碳與來自 DOPC 的 CH3 基團(tuán)的氫/來自 DOPE 的胺基團(tuán)的氫之間的RDF。部分磷脂按以下方式著色：青色-碳，藍(lán)色-氮，黃色-磷，紅色-氧，灰色-氫。DLin-MC3-DMA的部分以不同的方式著色：淺灰色-氫，深灰色-碳，藍(lán)色-氮和紅色-